مقاله رایگان درباره
TA، AT، AG، ریخته

مقاله رایگان درباره TA، AT، AG، ریخته

هود).
فنل ( Phenol ) ترکیبیه که از جایگزینی هیدروژن یه هسته آروماتیک با گروه هیدروکسیل ( OH ) ایجاد می شه. از این دید از نظر ساختمان شیمیایی ، فنل یه الکل نوع سوم مخصوص هست وبسیار سمیه .

شکل 3-10- محلول فنل روی یخ قرار داده می شه تا در زیر هود به نمونه ها اضافه بشه
15- سانتریفیوژ درrpm13000 به مدت 12 دقیقه .
16- مایع رویی رو ورداشته وبه حجم مساوی کلروفرم-ایزوآمیل اضافه کرده ومخلوط کنین بعد 20 دقیقه روی یخ بمونه.
این کار با دقت طوری انجام می شه که با زواید سلولی موجود در فاز پایینی مخلوط نشه.
17- سانتریفیوژدرrpm13000 به مدت 10 دقیقه و سوپر ناتانت(مایع رویی) ورداشته شه.
پس از عمل سانتریفوژدو فاز مشخص در هر میکروتیوب بوجود اومد سوپرناتانت یا مایع رویی که شامل DNA بوده به آرامی وبا احتیاط جدا شده وسپس به میکروتیوبای استریل دیگه منتقل شد.فاز پایینی دور ریخته شد.
18- اضافه کردن 10/1 حجم سدیم استات و2 حجم اتانول100% ونگهداری به مدت 1 ساعت روی یخ.
به میزان یه دهم حجم مایع رویی برداشت شده،سدیم استات وبه میزان دو برابر حجم محتویات هر میکرو تیوب،اتانول خالص سرد اضافه شده وبه مدت یه ساعت روی یخ قرار می دهیم.
19- سانتریفیوژدر rpm 14000 به مدت 10 دقیقه ومایع رویی دور ریخته شه.

شکل 3-11 – نگاه DNA ایجاد شده در انتهای تیوپ
20- Pellet با الکل 70%(150 میکرو لیتر) شسته وسانتریفیوژ باسرعت rpm14000 به مدت3 دقیقه واتانول دور ریخته و خشک شه و در TE(10:1) به مقدار 200 میکرو لیتر حل شه.
21- NaCl (M 5/2) برابر حجم اضافه بشه(یعنی 200 میکرولیتر) وخوب بهم بزنید و بعد 2 حجم الکل اتانول خالص (یعنی 400 میکرو لیتر) اضافه کرده وبمدت30 دقیقه روی یخ بمونه وسپس سانتریفیوژدر rpm 14000 به مدت 10 دقیقه .
22- مایع رویی دور ریخته شه ومجددا شستشو با اتانول 70% وسانتریفیوژ درrpm 14000 به مدت 3 دقیقه .
23- Pellet خشک شه (وکیوم 10 دقیقه) ودر TE(1/0 :10) به مقدار 200 میکرو لیتر حل شه ونگهداری در دمای 80 – درجه سانتی گراد .
پس از شستشو با اتانول،مایع رویی دور ریخته شده وتیوبا به شکل وارونه روی یه کاغذ صافی قرار داده بعد میکروتیوبای شامل pellet رو به دستگاه وکیوم منتقل کرده تا رسوبDNA خشک شه.به رسوب خشک شده 200 میکرولیتر بافرTE استریل اضافه شد .DNA درآورده شده تا زمان استفاده در یخچال ودر دمای20- درجه سانتی گراد نگه داری گردید.

شکل 3-12- پلیت شامل DNA رو در وکیوم گذاشته تا خشک شه.
3-4- تعیین کمیت وکیفیت DNA ژنومی
موفقیت بیشتر آزمایشای زیست شناسی مولکولی در مرحله اول وابسته به کیفیتDNA درآورده شده و دقت در محاسبه غلظت هستش. بنابر این پس از درآورده وقبل از انجام هرگونه آزمایشی باید حضورDNA اثبات شه ومقدار وکیفیت اون تعیین شه. بدین منظور از الکتروفورز افقی با ژل آگارز وبرای تعیین کمیتDNA از دستگاه اسپکتروفوتومتر استفاده شد.
3-4-1- اندازه گیری غلظت DNA به روش اسپکتروفتومتری
یکی دیگه از روشای عادی واسه تعیین غلظت و کمیتDNA ،محاسبه میزان جذب نوری در دستگاه اسپکتروفوتومتر هستش. در این روش طبق مقدارجذب نوری نمونه ،در طول موجای خاصی میشه مقدار DNA ودر صد خلوص اون نمونه رو تعیین کرد.
الان این روش معمولا واسه تعیین خلوص ومقدارDNA در نمونه ها به کار میره. اسیدای نوکلئیک با ترکیبی از چار نوکلئوتید،بیشتر نور فرا بنفش با طول موج 260 نانومتر رو جذب می کنن. پروتئینا که رایج ترین آلوده کنندهای اضافی در نمونه هایDNA می باشن نور فرابنفش رو در دو طول موج 260 و280 نانومتر جذب می کنن . زنجیره های پلی پپتیدی که معمولا دارای سه اسید آمینه حلقوی می باشن، طول موج 280 نانو متر رو بهتر جذب می کنن. اما برخی دیگه از پرو تئینا مثل هیستونا یاپروتامینا که بدون یا دارای تعداد کمی از اسیدای آمینه حلقوی می باشن در طول موج280 نانومتر بدون یا دارای کمه کم جذب نوری می باشن. از طول موج 230 نانومتر هم واسه تعیین آلوده کنندهای فنلی والکلی ونمکا استفاده می شودطول موج 320 واسه تعیین پلی ساکاریدا وسایر ترکیبات باقی مونده استفاده می شه.بنابر این با محاسبه جذب نو ری نمونه های DNA در طول موجای 230 ،260،280و320 ومحاسبه ی نسبتای جذب260به280 میشه خلوص DNA 31را مشخص کرد . میزان خلوص DNA درآورده شده از رابطه زیر بدست می آید:
P=?260 / ?280 = DNA میزان خلوص
به طور آیده ال نسبت 260 به280 که برآوردی نسبت DNA به پروتئین هاس باید بین 8/1 تا 2 باشه . در صورتی که این نسبت کمتر از این مقدار باشه کیفیت DNA کمتر از حدی هستش که بشه از اون در آزمایشای مولکولی استفاده کرد.
واسه تعیین غلظت DNA 32در یه نمونه طبق نانوگرم بر میکرو لیتر از رابطه زیر استفاده می شه:
q=(?260- ?320)×100×50
در این دستگاه از طول موجای 260 ، 280 ، 230 و320 نانومتر استفاده می شه. ظرفیت کوتا (سلا)1000 میکرولیتر بود قبل از عمل اندازه گیری غلظت DNA ،باید دستگاه کالیبره شه. واسه این کار اول کوتا رو با آب دو بار چکوندن شستشو داده ، بعد 990 میکرو لیتر آب دو بار تقطیرداخل اون می ریزیم یکی از کوتا در دستگاه قرار گرفت. با فشردن کلید کالیبره کردن مقادیر 260 و280 روی صفر تنظیم شد.بعد 10 میکرولیتر از استوکی که قبلا تهیه شده بود وحاوی نمونه هایDNA بود در کوت دستگاه ریخته شد پس از اضافه کردن DNA ،کوت در دستگاه قرار داده شد ومقدار اعداد در طو
ل موجای به ترتیب 320،280،260،230 ثبت گردید که به ترتیب نشون دهنده نمکا ،اسیدای نوکلئیک ، پروتئینا و هیدارتای کربن وسایر ترکیبات هستش.

مطلب مرتبط :   پایان نامه ارشد با موضوعکارکرد سازمان، کارکرد اقتصادی، کارکرد سازمانی، مسئولیت اجتماعی

شکل 3- 13- تعیین کیفیت DNA به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتری با طول موجهای 230-260-280,320
3-4-2 – اندازه گیری کیفیت DNA با استفاده از ژل آگارز
یکی از روشای راحت انتخاب DNA با کیفیت عالی وفاقد شکستگی وتعیین حضور یا نبود حضور اون،استفاده از الکتروفورز افقی به وسیله ژل آگارز 8/0 % هستش. در این غلظت آگارز،قطر منفذای ژل بزرگ می باشن و واسه بارگذاری DNA استخراجی که به شکل توده ای و به هم فشردهه، مناسب بوده وامکان حرکت DNA روی ژل رو فراهم می بیاره. جهت استفاده از ژل با ظرفیت 25 میلی لیتر ونیز تهیه آگارز 8/0 در صد،2/0 گرم آگارز رو درون یه ارلن ریخته و به وسیله بافر TAE به حجم 25 میلی لیتر می رسانیم. محلول تهیه شده رو درون مایکروفر قرار داده تا آگارز حل وذوب شه. بعد اجازه می دهیم این محلول در دمای محیط سرد شه،طوریکه دست رو نسوزاند (حدود 60 درجه سانتی گراد).به خاطر نگاه باندا ونشاندار کردن DNA بی تغییر اون به میزان 5/1 میکرو لیتر اتیدیوم بروماید(مایع قرمز رنگ،خیلی سمی وسرطانزا)به اون می افزاییم ،شانه رو در مخزن ژل قرار داده وسپس ژل رو درون مخزن می ریزیم.مخزن ژل باید روی یه سطح تراز بگیره تا ضخامت اون در همه قسمتا یکنواخت شه. وگرنه هنگام برقرار کردن جریان وشروع به کار دستگاه، DNA از راه اصلی خود منحرف میشه.پس از 20 دقیقه که ژل بسته شد،شانها رو به آرامی وبه گونه ای که ژل نشکند، از ژل جدا می کنیم. و روی ژل بافر TAE 1Xبه مقدار لازم که سطح ژل رو بپوشونه می ریزیم در محل دندانه های شانه، چاهکایی در ژل ساخته میشه که میشه DNA رو درون این چاهکا بارگذاری کرد. پس از بارگذاری تموم نمونه ها،تانک ژل رو به منبع برق وصل کرده وجریان 50 ولت به مدت 45 دقیقه رو برقرار می کنیم .بعد از تموم شدن الکتروفورز به خاطر نگاه باندها،ژل رو به آرامی از سینی الکتروفورز جدا کرده ودر آخر ژل رو در دستگاه ژل داکیومنت (شکل 3-14) قرار داده و با استفاده از نور ماورای بنفش،باندهای DNA نگاه می شه.

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه درموردسیستم مدیریت، مدیریت کیفیت، مدیریت محیط، سیستمهای مدیریت

شکل 3-14- دستگاه ژل داکیو منتیشن واسه عکس ورداری از ژل
وجود یه باند کلفت و روشن در قسمت بالای ژل بی کشیدگی،نشون دهندهDNA با کیفیت عالی هستش(شکل 3-15 )وجود کشیدگی در فاصله بین چاهک وباند نشونه وجود آلودگی پروتئینی یا بقیه آلودگی هاس. وجود یه باند اضافی در پایین ژل و در فاصله ای زیاد از باند اصلی ،نشونه وجود RNA در نمونه ها هستش.

شکل 3-15- پروفیل باندی 22 نمونه انتخاب شده DNA
3-4-2-1- آماده کردن نمونه ها جهت تعیین کیفیت DNA
در این مرحله میزان 5/2 میکرولیتر DNA خالص مرزه هر نمونه رو با2 میکرو لیتر ماده آبی رنگی 6x DNA Loading dye مخلوط کرده و به آرامی بداخل چاهکای ژل آگارز تزریق می کنیم.
3-5- افزایش کیفیت DNA
پس از انجام اسپکتروفتومتری اگر نسبت OD 260/ OD280 بیش از2 ویا کمتر از 3/1 باشه ویا در صورت ایجاد اسمیر واسه افزایش کیفیت DNA نمونه ها رابطور دوباره شستشو می دهیم.
3-5-1- قرارداد شستشوی مجددDNA
1- اضافه کردن 2 حجم اتانول خالص سرد(400 میکرولیتر) وقرار دادن بمدت 40 دقیقه در 20- درجه سانتی گراد.
2- سانتریفوژ rpm 6000 بمدت 3 دقیقه.
3- مایع رویی دور ریخته شه.
4- Pellet رو با اتانول 70% سرد می شوییم.
5- سانتریفوژ در rpm7000 در 3 دقیقه.
6- مایع رویی دور ریخته شه.
7- Pellet رو خشک می کنیم(وکیوم 3 دقیقه).
8- دوباره در 150 میکرولیتر(0.1 : 10)TE حل شه.
3-5-2- قرارداد شستشوی DNA هنگام تولید اسمیر
1- اضافه کردن 2 میکرولیتر RNase ونگهداری در 37 درجه سانتی گراد (1 ساعت).
2- اضافه کردن یه حجم ایزوآمیل-کلروفرم ورتکس کوتاه وسانتریفوژ در rpm 14000 بمدت 15 دقیقه.
3- مایع رویی ورداشته شه.
4- اضافه کردن 10/1 حجم سدیم استات و2 حجم اتانول خالص،نگهداری در 80- درجه سانتی گراد (یه ساعت).
5- سانتریفوژ در rpm 14000 بمدت 10 دقیقه.
6- مایع رویی دور ریخته شه شستشو با اتانول 70% ،بعد سانتریفوژ در rpm 14000 بمدت 3 دقیقه.
7- مایع رویی رو دور ریخته شه.
8- Pellet خشک شه(وکیوم 10 دقیقه).
9- اضافه کردن 200 میکرولیتر(1/0: 10)TE و نگهداری در 20- درجه سانتی گراد.
3-6- مراحل اجرای تکنیک ISSR
3-6-1- رقیق کردن نمونه ها
واسه تهیه نمونه های مناسب PCR اول نمونه ها رو با آب دیونیزه تا حد 5 نانوگرم رقیق می کنیم بدین صورت که مقداری از DNA نمونه رو با H2O dd در تیوبای جدید مخلوط می کنیم.
3-6-2 – افزایش ISSR
3-6-2-1- استفاده از پرایمرا
با مطالعه وبررسی پژوهشای انجام شده با استفاده از بیان کننده مولکولی ISSR واسه سه گونه مرزه مورد مطالعه ، 10 پرایمر تصادفی انتخاب شدن (جدول3-3). این آغازگرها به شکل خشک تهیه شده بود که با آب دو بار چکوندن استریل ،رقیق شده ودر فریزر نگهداری می شن.
ساخت آغازگرها به وسیله شرکت آلمانی انجام شد.از میون آغازگرها سه شروع کننده با تولید نوارهای چند شکلی استفاده شدن.بقیه آغازگرها نوار چند شکل تولید نکردند یا ضعیف ونامشخص بود مشخصات آغازگرها درجدول زیر آمدهه .
جدول 3-3 – فهرست آغازگرهای مورد استفاده و پشت سر هم اونا
ردیف
نام شروع کننده
پشت سر هم
1
UBC808
AG AG AG AG AG AG AG AG C
2
UBC 820
GT GT GT GT GT GT GT GT C
3
UBC 844
CT CT CT CT CT CT CT CT RC
4
UBC 801
AT AT AT AT AT AT AT AT T
5
UBC 802
AT AT AT AT AT AT AT AT G
6
برای دانلود متن کامل فایل این  پایان نامه می توانید  اینجا کلیک کنید

دیدگاهتان را بنویسید

Close Menu